细胞相关

稳转细胞株构建

货号
:
服务项目实验内容明细实验周期客户提供交付结果
稳转细胞株(慢病毒细胞株)构建构建病毒表达载体30个工作日提供基因属性、标签细胞株、原始数据、分析结果、实验报告
慢病毒包装/
慢病毒纯化/
慢病毒滴度检测慢病毒溶液
慢病毒感染目的细胞细胞株
抗生素筛选/
稳转细胞株鉴定(WB(不提供抗体)、QPCR)WB检测需提供目的抗体、QP提供基因属性


稳转细胞系构建中常见问题:

1. 是否需要进行密码子优化?

由于氨基酸密码子的简并性和tRNA的种类多样性、数量的差异,密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性,可以大幅提高目标蛋白的表达量。

2. Kozak序列是必须要添加的吗?

Kozak序列(通常是GCCACCatgG),真核生物mRNA真正的起始密码子位于Kozak序列的保守序列中,其共有序列是CCRCCAUGG,几乎所有mRNA的翻译起始都依赖于5’帽子结构募集小亚基,少数通过内部核糖体进入位点(IRES)募集小亚基。Kozak序列通过与翻译起始因子eIF形成翻译起始复合物,起始蛋白的翻译。

3. 启动子的选择

CMV(巨细胞病毒)启动子除了在干细胞外,其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中SFFV启动子表达活性相对较高。而EF1a(延伸因子-1α)启动子更适用于表达长片段的基因。CMV;EF1A;CAG;CBh;SFFV,等均属于强启动子,都可作为稳转细胞系构建可选启动子。

4. 稳转细胞系培养体系

稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长,如hepG2细胞puro抗性筛选浓度为2μg/ml,则建议用1ug/mL+完全培养基维持生长;部分基因过表达后会影响细胞代谢,尤其肿瘤细胞,糖酵解代谢速率受影响,细胞生长缓慢,可相应添加葡萄糖或者HEPES调节细胞细胞代谢水平,维持细胞增殖。

5. 标签放在N端还是C端好?

如果N端有信号肽,建议放在C端;蛋白如果较小,建议放在C端,减少蛋白降解;如果下游有P2A,T2A等自剪切肽,建议放在C端。如果为了添加Kozak序列,建议加在N端。如果纯化中需要酶切标签,建议放在N端。

6. 是否可以构建稳转敲除的细胞系?

一般不建议,因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中,累积脱靶效应明显,影响细胞状态。