外泌体microRNA提取试剂盒

（磁珠型）

一、运输与存储条件。

1.    本试剂盒常温运输，并根据各组份存储条件分开保存。

2.     磁珠4 ℃保存（严禁冻存，否则失效），其它试剂常温保存，有效期12个月。

二、注意事项（请使用试剂盒前阅读此注意事项）。

1.     磁珠4 ℃保存，严禁冻存，否则失效。使用前充分震荡（Vortex），重悬。

2.     请使用 RNase-free 的器具与耗材，如EP管，枪尖等。

3.     整个实验过程需要低温操作。

4.     请使用新鲜的外泌体样品或-80 ℃保存的外泌体样品，避免microRNA降解。

5.     为了您的健康，实验过程中请穿好实验服、佩戴手套和安全眼镜。

三、产品简介。

本产品是一款以磁珠为纯化介质的外泌体microRNA提取试剂盒，专门用于提取外泌体中的microRNA，用于反转录、Northern Blot或测序等生物学实验。也可同时纯化外泌体中的DNA，用于相关实验。

四、特点与优势。

1.     简单、快速提取外泌体溶液中的microRNA。

2.     磁珠可以有效吸附microRNA，提高microRNA产量和纯度。

3.     DNA去除柱可有效去除外泌体中的DNA，提高microRNA的纯度。

4.     可以同时提取外泌体中的DNA，实现外泌体中DNA与microRNA的同时提取。

五、自备试剂与耗材。

  异丙醇，无水乙醇，15 ml离心管，RNase-free EP管和枪尖。

六、使用说明。

1.       试剂配置。在 Wash Buffer D（漂洗液）中加入 21 mL 无水乙醇，混匀。

2.       外泌体裂解。按照外泌体溶液：miRNA裂解液（Lysis Buffer for microRNA）=1:3的比例，在1 mL外泌体溶液中加入3 mL 裂解液（Lysis Buffer for miRNA），混匀，室温静置3-5 min。

3.       将混合液体转移至DNA去除柱内，12, 000 g，4 ℃离心2 min，保留滤液，DNA去除柱转移至新的15 ml离心管中，用于提取外泌体DNA。

4.       向滤液中加入等体积的异丙醇（4 ml，使异丙醇的终浓度达到50%以上），颠倒混匀。

5.       加入50 μL磁珠（吸取磁珠前先震荡混匀），置于静音混合器中4 ℃旋转孵育30 min。

6.       取出离心管，置于磁力架上，使磁珠聚集；或置于离心机中，3, 000 g，4 ℃离心2 min，沉淀磁珠。弃上清。

7.       加入500 μL Wash Buffer C（去蛋白液），轻微震荡（Vortex，1,000 rpm）30 sec，洗涤磁珠，离心法或磁力法沉淀磁珠，弃上清。

8.       加入500 μL Wash Buffer D（漂洗液，注意是否加入乙醇）, 轻微震荡（Vortex，1,000 rpm）30 sec，洗涤磁珠，离心法或磁力法沉淀磁珠，弃上清。

9.       3, 000 g，4 ℃离心2 min，沉淀磁珠，用移液枪移除残液。

10.   加入100 μL Elution Buffer R或RNase-free ddH₂O，震荡（Vortex，2,000 rpm），30 sec，洗脱RNA。

11.   置于磁力架上使磁珠聚集，或7, 000 g，4 ℃离心2 min，沉淀磁珠。转移上清液至新的EP管中，即为microRNA溶液。

12.   测定microRNA浓度与纯度，用于反转录或其它实验，或保存于-80 ℃冰箱。

若需要提取外泌体中的DNA，则进行以下步骤。

1)      在DNA去除柱中加入2 ml 75%乙醇，7, 000 g，4 ℃离心1 min，弃滤液。

2)      重复上一步骤，再次洗涤DNA去除柱。

3)      7, 000 g，4 ℃离心1 min，彻底去除柱中残液，转移DNA去除柱至新的15 ml离心管中。

4)      在DNA去除柱中央滴加300-500 μl Elution Buffer R或ddH₂O，室温静置2 min，转入离心机，12, 000 g，4 ℃离心1 min，弃DNA去除柱，滤液即为DNA溶液。

5)      立即测定DNA的浓度，或保存在-20℃。

八、常见问题与分析。