慢病毒包装试剂盒

一、运输和存储条件

1.    本产品低温运输，各组份依据保存条件分开保存，有效期为2年。

2.    Omifection与Polybrene 4 ℃保存，严禁冻存。  

二、注意事项（请使用试剂盒前阅读此注意事项）

1.    Lenti-Mix和Lenti-GFP体积较小，使用前12,000×g，4 ℃离心30 sec，使质粒溶液沉到管底。

2.    请使用高纯度的Lenti-shRNA质粒或表达目的蛋白的慢病毒质粒进行转染实验，质粒DNA的OD260/OD280比值在1.7～1.9之间为宜。

3.    293T（N）细胞的生长状态对于慢病毒包装至关重要，一般使用代数较低（20代以内）的293T（N）细胞进行慢病毒包装。

4.    转染慢病毒质粒时，293T细胞的密度应该控制在60-80%之间，密度过低，生产的慢病毒较少；密度过高，则影响质粒转染效率，也会减少慢病毒产量，导致慢病毒滴度降低。

5.    本试剂盒提供的Omifection（质粒DNA转染试剂）与Polybrene（慢病毒感染增强试剂），保存在4 ℃，严禁冻存。

6.    为了增强慢病毒感染效果，可以使用本公司的慢病毒感染增强试剂盒（Cat：OmL-04），其感染增强效率比Polybrene高4-8倍。

7.    为了您的健康，请穿实验服、佩戴乳胶手套和安全眼镜，使用安全工作台，避免慢病毒感染。

三、产品简介

本产品包括慢病毒包装质粒（Lenti-Mix）、阳性对照质粒（lenti-GFP）、质粒DNA转染试剂（Omifection）和病毒感染增强试剂（Polybrene），其中包装质粒能够与已经构建的慢病毒骨架质粒联合，生产高滴度的慢病毒。

四、特点与优势

1.    本试剂盒中的包装质粒能够与多家公司提供的慢病毒骨架质粒配合，生产高滴度的慢病毒。

2.    本试剂盒中的转染试剂Omifection，可以转染分子量较大的慢病毒质粒，保证转染效率，提高病毒产量。

五、自备试剂与耗材

1.    OPTI-MEM 培养液 (Gibco)

2.    293T细胞，最好是293TN细胞（System Biosciences），病毒生产量大。

六、 使用说明

1.    慢病毒包装。

1)    细胞培养。293T细胞传代接种于细胞培养皿（Φ 100 mm），置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养，24 h后细胞密度达到60%～80%。（细胞密度不宜过大，否则影响转染效率）

2)    转染。向Lenti-Mix中加入1 mL OPTI-MEM 培养液，再加入9 μg慢病毒骨架质粒（目的蛋白过表达或RNAi质粒，或一管GFP对照质粒），混匀，加入54 μL转染试剂Omifection，混合10次，室温静置30 min，滴加入细胞培养液中，轻轻摇匀。

3)             换液。转染6-12 h，更换成新鲜的细胞培养液，继续培养。

4)    慢病毒收集。转染48 h，收集第一批含有慢病毒的细胞培养上清（暂时置于4 ℃保存），

5)    293T细胞中再加入10 ml新鲜的细胞培养液，24-48 h后，收集第二批含有慢病毒的细胞培养上清（第二批细胞培养上清中的慢病毒滴度高于第一批）。

6)    离心。含有慢病毒的细胞培养上清转入离心机，3,000 rpm（离心力为870 g），4 ℃离心5 min，弃沉淀，上清转入新的无菌离心管，即是含有慢病毒的细胞培养上清。

7)    用慢病毒滴度检测卡测定慢病毒滴度或利用本公司的慢病毒纯化试剂盒（Cat：OmL-02）纯化慢病毒。

8)    含有慢病毒的细胞培养上清可在4 ℃保存1个月，长期保存应置于-80 ℃，但冻融一次，病毒感染效果降低30-50%。

2.    慢病毒感染。

1)    目的细胞培养。目的细胞传代后接种到细胞培养皿（Φ 100 mm）中，24 h后细胞密度达到30%-60%。

2)    慢病毒感染。弃培养液，加入5 ml新鲜培养液和5 mL含有慢病毒的细胞培养上清液，再加入5-20 μl的polybrene（与细胞培养液按照1: 500-1:2000稀释），轻摇，混匀。

3)    换液。病毒感染12-24 h后，更换成新鲜的培养液，继续培养，若无细胞毒性，可以不换液。

4)    检测。慢病毒感染72 h，荧光显微镜下观察GFP表达情况，或检测目的基因表达水平。 

七、常见问题与分析