外泌体提取方法

外泌体纯化试剂盒

（磁珠型）

一、运输与存储条件。

   本产品常温运输，4 ℃保存，有效期2 年。

二、注意事项（请使用试剂盒前阅读此注意事项）。

1. 磁珠4℃存放，严禁冻存，否则失效。

2. 实验过程中所用的PBS和ddH₂O都必须使用滤膜孔径为0.2 μm的滤器过滤，避免液体中的杂质颗粒导致的外泌体纯度降低。

3. 本试剂盒适用于细胞培养上清、尿液及其他液体样品中的外泌体纯化。

4. 本试剂盒不适合提取高度浓缩的细胞培养上清中的外泌体。因为细胞培养上清高度浓缩后，杂蛋白和杂质含量显著升高，能够与磁珠发生非特异性吸附，降低外泌体纯度。

5. 磁珠长期静置存放会沉到管底，吸取磁珠前请先充分混匀（Vortex）。

6. 建议用新鲜提取的外泌体进行NTA检测。

7. 外泌体过滤时建议先用PBS润洗针式过滤器，以减少外泌体溶液的损失。

8. 纯化后的外泌体可保存在-80 ℃冰箱中，避免反复冻融导致的外泌体破裂。

9. 本试剂盒提供的外泌体纯化体系为20 ml/样品，若样品较少，可以用无菌的ddH₂O补齐体积。也可以按照比例减少试剂盒中各试剂的用量（请勿随意更改各试剂比例，易导致外泌体纯化失败），构建小体系外泌体纯化系统，但每个样品中磁珠用量不得少于0.2 ml，否则降低外泌体纯化效果。

10. 为了您的健康，实验过程中请穿好实验服、佩戴乳胶手套和安全眼镜。

三、产品简介。

本产品是一款以磁珠为分离材料的外泌体纯化试剂盒。在特定的缓冲体系中，磁珠可吸附外泌体，并被洗脱液（PBS或ddH₂O）洗脱下来，从而完成外泌体的分离与纯化。同时，利用PBS或ddH₂O洗脱后的外泌体不含其它化合物，可直接用于细胞培养实验和动物体内注射。

四、特点与优势。

1. 本试剂纯化效率高，外泌体纯化回收率高。

2. 本试剂盒纯化的外泌体纯度高，外源杂蛋白含量低。

3. 本试剂盒操作简单，能够快速（2 h）完成外泌体纯化。

4. 本试剂盒操作温和，纯化的外泌体完整性好。

5. 本试剂盒纯化的外泌体不含其它化合物，可直接用于细胞培养实验和动物体内注射实验。

五、使用说明。

1. 本产品主要用于细胞培养上清等体积较大的液体样品中外泌体的分离纯化。

2. 样品准备。细胞培养上清转入离心管，3000 g，4 ℃离心5 min，弃沉淀，上清转移至新的离心管中，用于外泌体纯化。

3. 磁珠准备。取出试剂盒中的瓶装磁珠，震荡混匀（Vortex）30 sec，利用移液器吸取0.2 ml磁珠，加入50 ml离心管中，3000 g，4 ℃离心2 min，弃上清。

4. 磁珠洗涤。加入10 ml，4 ℃预冷的PBS，震荡混匀（Vortex）30 sec，3000 g，4 ℃离心5 min，弃上清。

5. 
外泌体纯化体系。本产品提供的外泌体纯化体系是20 ml，各组份如下表。

表1. 外泌体纯化体系表

6. 外泌体纯化体系配制。根据外泌体纯化体系表，配制外泌体纯化体系，若样品体积不足15.6 ml时，可以用ddH₂O补齐体积。也可以按照比例减少试剂盒中各试剂的用量（请勿随意更改各试剂比例，易导致外泌体纯化失败），构建小体系外泌体纯化系统，但每个样品中磁珠用量不得少于0.2 ml，否则降低外泌体纯化效果。

7. 孵育。外泌体纯化体系配制完成后，置于旋转混合器中，4 ℃旋转混合60 min。

8. 磁珠收集。孵育完毕将离心管转入离心机，3000 g，4 ℃离心5 min，沉淀磁珠，弃上清；或将离心管置于磁力架上，4 ℃静置5-10 min，使磁珠聚集，弃上清。

9. 残余液体去除。将装有磁珠沉淀的离心管转入离心机，3000 g，4 ℃离心1 min，，用移液器吸尽管中残余液体。

10. 外泌体洗脱。加入0.3-1.0 ml Buffer EXE（PBS或ddH₂O，洗脱液体积较大时，得到的外泌体浓度较低，反之，则高），剧烈振荡（Vortex）30 sec。

11. 外泌体收集。7000 g，4 ℃离心2 min，将离心管置于磁力架上（可以有效聚集磁珠，防止磁珠散落在溶液中，降低外泌体纯度），转移上清至新的EP管中，即为纯化的外泌体溶液。

12. 过滤。利用PBS润洗针式过滤器A和B（即用这两种滤器过滤5 ml PBS），并利用针式过滤器A过滤外泌体溶液，除去体积较大杂质。滤液再用针式过滤器B过滤，除去体积较小的杂质，得到高纯度的外泌体溶液。

13. 纯化的外泌体溶液可立即用于粒径检测（NTA分析），或保存在-80 ℃。